细胞裂解液的制备

一、试剂准备

1. 新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液: 150mM NaCl, 1% NP-40（去垢剂）, 0.1% SDS（去垢剂）, 2µg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂，使用前添加）, 2µg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂，使用前添加）, 1mM PMSF（蛋白酶抑制剂）, 15mM EDTA（蛋白酶抑制剂）, 1mM Na Vanadate（磷酸脂酶抑制剂，可选）。所有试剂均按比例溶于150mM NaCl溶液中。

2. 在冷PBS中加入1mM PMSF、15mM EDTA及1mM Na Vanadate（可选）。

3. 选择对数生长期且生长状态良好的细胞，准备至少3-4瓶75cm²的培养瓶（生长面积90%以上）。

二、实验步骤

1. 将长满细胞的培养瓶放置于冰上，使用吸液管吸出培养液。加入足量冷PBS对细胞表面进行充分洗涤，以去除瓶中残留的培养基，倒掉PBS，并重复洗涤2-3次。在最后一次洗涤时尽量吸干残留PBS，操作全过程应尽量在冰上进行。

2. 向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液（每75cm²培养瓶加1ml），然后使用细胞刮刀沿瓶壁轻轻划拉细胞。如果需要从多个瓶中刮取同种细胞，将第一瓶的细胞裂解液吸出并转入下一瓶继续操作（由于裂解液较粘稠，建议使用直径稍大的吸液管）。

3. 吸出刮好的细胞裂解液，放入14ml离心管中（保持在冰上），然后重复上述步骤以刮取剩下的细胞。

4. 尽可能收集更多的细胞裂解液到14ml的离心管中，并将样品放入冰盒进行超声处理。超声强度应控制在不产生泡沫的范围内，每次超声2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，需离心10000rpm，10分钟，并保留上清液。

5. 取出少量细胞裂解液测定蛋白浓度（可使用Biorad Bradford试剂盒或紫外分光光度计在A280处测定），并将其分装保存于-70℃。细胞裂解可通过物理或化学方法实现。

物理法：

（1）反复冻融法：将细胞交替置于-20℃和25-30℃环境中，进行10-20次反复冻融，适用于大多数哺乳动物细胞，如血细胞。

（2）煮沸法：与冻融法相反，将细胞放置于100℃的沸水中煮沸5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。

（3）超声法：将细胞置于超声破碎仪中，以特定频率进行超声破碎，适合大多数微生物细胞。

（4）渗透压法：将膜较薄的细胞（如血细胞）置于低渗溶液（如纯水）中，细胞因吸水而破裂。

（5）液氮法：植物细胞通常使用液氮捻磨方法进行扩裂。

化学法：

（1）强酸、强碱溶液：一般使用0.5N NaOH溶液可以裂解大部分动物细胞和微生物细胞。

（2）生物酶：通常使用溶菌酶、蛋白酶K等酶来裂解微生物细胞。

在生物医疗领域，细胞裂解液的制备是研究蛋白质组学的重要步骤，品牌人生就是博-尊龙凯时致力于推动生物医疗技术的进步，为研究人员提供全面的实验支持。